在化妝品安全性評(píng)估體系中，皮膚光毒性試驗(yàn)是排查“光敏風(fēng)險(xiǎn)”的核心環(huán)節(jié)。無論是美白、防曬類產(chǎn)品，還是含植物提取物的護(hù)膚品，都需通過規(guī)范的試驗(yàn)流程驗(yàn)證安全性——從前期樣品的精準(zhǔn)制備，到試驗(yàn)過程的嚴(yán)格操作，再到最終科學(xué)的結(jié)果判定，每一步都直接影響檢測(cè)結(jié)論的準(zhǔn)確性。

　　化妝品皮膚光毒性試驗(yàn)完整流程

　　1.樣品制備：

　　化妝品形態(tài)多樣，需通過標(biāo)準(zhǔn)化方法將其轉(zhuǎn)化為可用于試驗(yàn)的“均一體系”，避免因樣品不均導(dǎo)致結(jié)果偏差。具體流程如下：

　　固體/半固體樣品（膏霜、面膜）：取10-20g樣品，加入適量生理鹽水或無血清培養(yǎng)基，在37℃恒溫水浴中攪拌至完全溶解，通過0.22μm無菌濾膜過濾，制備成5個(gè)梯度濃度的樣品溶液。

　　液體樣品（精華、爽膚水）：直接用無血清培養(yǎng)基稀釋至目標(biāo)濃度，若含酒精、香精等揮發(fā)性成分，需先在4℃低溫環(huán)境下平衡2小時(shí)，避免稀釋過程中成分揮發(fā)影響濃度準(zhǔn)確性。

　　特殊劑型（噴霧、粉餅）：噴霧樣品需收集霧化后的液體，粉餅樣品則研磨成細(xì)粉后，按固體樣品制備方法溶解稀釋。

　　關(guān)鍵要求：樣品制備全程需在無菌超凈工作臺(tái)操作，每個(gè)濃度設(shè)置3個(gè)平行樣，同時(shí)制備“空白對(duì)照液”和“陽性對(duì)照液”。

　　2.體外試驗(yàn)：

　　3T3中性紅攝取光毒性試驗(yàn)方法通過觀察細(xì)胞在“樣品+紫外線”作用下的存活率，判斷光毒性，全程約5-7天，具體流程分為“細(xì)胞處理-紫外線照射-毒性檢測(cè)”三階段：

　　階段1：細(xì)胞染毒與分組培養(yǎng)（第1-2天）

　　分組設(shè)置：將96孔板分為4組，每組3個(gè)平行孔，確保變量唯一：

　　①加藥照射組：加入不同濃度樣品溶液+后續(xù)紫外線照射；

　?、诩铀幈芄饨M：加入不同濃度樣品溶液+全程避光培養(yǎng)；

　?、劭瞻渍丈浣M：僅加無血清培養(yǎng)基+后續(xù)紫外線照射；

　?、芸瞻妆芄饨M：僅加無血清培養(yǎng)基+全程避光培養(yǎng)。

　　染毒培養(yǎng)：將4組培養(yǎng)板放入37℃CO?培養(yǎng)箱，培養(yǎng)24小時(shí)（讓細(xì)胞充分接觸樣品成分，模擬皮膚接觸化妝品后的吸收過程）。

　　階段2：紫外線照射與后續(xù)培養(yǎng)（第3天）

　　照射前準(zhǔn)備：取出培養(yǎng)板，吸棄孔內(nèi)舊培養(yǎng)基，用PBS緩沖液輕柔沖洗2次（去除未被細(xì)胞吸收的樣品殘留，避免干擾照射效果），再加入新鮮無血清培養(yǎng)基。

　　紫外線照射：僅對(duì)“加藥照射組”和“空白照射組”進(jìn)行紫外線照射，照射過程中培養(yǎng)板需置于冰浴托盤（維持25±2℃，避免照射產(chǎn)生的熱量損傷細(xì)胞），照射時(shí)間根據(jù)校準(zhǔn)后的劑量計(jì)算（通常為20-30分鐘）；“加藥避光組”和“空白避光組”則用鋁箔紙包裹培養(yǎng)板，置于同一培養(yǎng)箱中避光處理。

　　后續(xù)培養(yǎng)：照射完成后，所有組均放回37℃CO?培養(yǎng)箱，繼續(xù)培養(yǎng)24小時(shí)（觀察細(xì)胞在照射后的損傷反應(yīng)）。

　　階段3：中性紅染色與細(xì)胞存活率檢測(cè)（第4天）

　　染色操作：吸棄孔內(nèi)培養(yǎng)基，每孔加入50μL中性紅染液（濃度0.05%，提前用PBS配制并過濾），37℃孵育3小時(shí)（中性紅可被活細(xì)胞吞噬進(jìn)入溶酶體，死細(xì)胞無此能力）。

　　脫色與檢測(cè)：用PBS沖洗3次去除多余染液，每孔加入100μL脫色液（乙酸：乙醇：水=1:50:49），室溫振蕩30分鐘至細(xì)胞內(nèi)染料完全釋放，隨后用酶標(biāo)儀在540nm波長(zhǎng)下檢測(cè)每孔吸光度（OD值）。

　　3.結(jié)果判定：

　　試驗(yàn)數(shù)據(jù)需通過標(biāo)準(zhǔn)化計(jì)算，結(jié)合法規(guī)閾值判定樣品是否具有光毒性，體外試驗(yàn)（3T3NRUPT）結(jié)果判定如下：

　　通過計(jì)算“細(xì)胞存活率”和“光毒性指數(shù)（PI）”評(píng)估風(fēng)險(xiǎn)，具體公式如下：

　　細(xì)胞存活率（%）：

　　加藥組存活率=（加藥組平均OD值/空白對(duì)照組平均OD值）×100%

　?。ㄗⅲ杭铀幷丈浣M對(duì)應(yīng)空白照射組，加藥避光組對(duì)應(yīng)空白避光組）

　　光毒性指數(shù)（PI）：

　　PI=加藥避光組50%細(xì)胞毒性濃度（IC50）/加藥照射組50%細(xì)胞毒性濃度（IC50）

　?。↖C50指使細(xì)胞存活率降至50%的樣品濃度，通過不同濃度存活率擬合曲線計(jì)算得出）

　　判定標(biāo)準(zhǔn)（依據(jù)OECD指南432）：

　　若PI≥5，且加藥照射組細(xì)胞存活率隨濃度升高顯著下降（呈現(xiàn)劑量依賴性），判定為“具有光毒性”；

　　若PI<3，且無劑量依賴性，判定為“無明顯光毒性”；

　　若3≤PI<5，需增加1個(gè)更高濃度樣品重復(fù)試驗(yàn)，或結(jié)合“人角質(zhì)形成細(xì)胞光毒性試驗(yàn)”進(jìn)一步驗(yàn)證。