狗糧微生物檢測(cè)是保障犬類食用安全的關(guān)鍵防線，其重要性在于能夠及時(shí)檢出菌落總數(shù)、沙門氏菌、大腸桿菌等有害微生物，這些微生物超標(biāo)不僅會(huì)導(dǎo)致狗糧霉變變質(zhì)，還會(huì)使犬類出現(xiàn)嘔吐、腹瀉等急性腸胃疾病，長期攝入受污染的狗糧甚至?xí)p害犬類免疫功能，同時(shí)通過微生物檢測(cè)也能倒逼生產(chǎn)企業(yè)規(guī)范生產(chǎn)環(huán)境的衛(wèi)生管理，從加工環(huán)節(jié)減少微生物污染風(fēng)險(xiǎn)，切實(shí)守護(hù)寵物的健康。

　　狗糧微生物檢測(cè)方法

　　狗糧微生物檢測(cè)中，沙門氏菌快速篩查和菌落總數(shù)計(jì)數(shù)是保障寵物食品安全的核心項(xiàng)目，需嚴(yán)格遵循相關(guān)規(guī)范操作，具體方法如下：

　　1、狗糧菌落總數(shù)計(jì)數(shù)規(guī)范

　　菌落總數(shù)反映狗糧受微生物污染的總體程度，計(jì)數(shù)結(jié)果直接判定其衛(wèi)生狀況，操作流程需滿足無菌化、標(biāo)準(zhǔn)化要求。

　　1)樣品前處理

　　在無菌操作間內(nèi)，稱取25g均勻粉碎的狗糧樣品，放入盛有225mL無菌生理鹽水的均質(zhì)袋中。

　　用拍擊式均質(zhì)器拍打1~2min，制成1:10的樣品勻液；若樣品含油脂較多，可加入適量無菌吐溫-80助溶。

　　進(jìn)行梯度稀釋：取1mL1:10勻液注入9mL無菌生理鹽水，混勻后制成1:100稀釋液，以此類推，根據(jù)樣品污染程度制備1:103、1:10?等系列稀釋液。

　　2)接種與培養(yǎng)

　　選擇2~3個(gè)適宜稀釋度，分別吸取0.1mL稀釋液，均勻涂布于營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基平板表面；也可采用傾注法，吸取1mL稀釋液注入無菌平皿，再加入15~20mL冷卻至46℃左右的營養(yǎng)瓊脂，輕輕搖勻，待培養(yǎng)基凝固。

　　每個(gè)稀釋度設(shè)置2個(gè)平行平板，同時(shí)設(shè)置空白對(duì)照（僅接種無菌生理鹽水）。

　　將平板倒置，放入36℃±1℃恒溫培養(yǎng)箱，培養(yǎng)48h±2h。

　　3)菌落計(jì)數(shù)與結(jié)果判定

　　選取菌落數(shù)在30~300cfu之間的平板進(jìn)行計(jì)數(shù)，低于30cfu的平板記錄具體菌落數(shù)，高于300cfu的平板記為“多不可計(jì)”。

　　計(jì)算平行平板的菌落數(shù)平均值，再乘以稀釋倍數(shù)，即為每克狗糧中的菌落總數(shù)，單位以cfu/g表示。

　　空白對(duì)照平板不得出現(xiàn)菌落，否則實(shí)驗(yàn)無效，需重新檢測(cè)。

　　2、狗糧沙門氏菌快速篩查方法

　　沙門氏菌是寵物食品中嚴(yán)禁檢出的致病菌，快速篩查可縮短檢測(cè)周期，常用方法為酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）結(jié)合生化鑒定確證，具體步驟如下：

　　1)增菌處理（前增菌+選擇性增菌）

　　前增菌：稱取25g狗糧樣品，放入225mL緩沖蛋白胨水（BPW）中，36℃±1℃培養(yǎng)16~20h，目的是讓受損傷的沙門氏菌恢復(fù)活性。

　　選擇性增菌：取1mL前增菌液，分別接種至10mL四硫磺酸鈉煌綠增菌液（TTB）和10mL亞硒酸鹽胱氨酸增菌液（SC）中，TTB置于42℃±1℃培養(yǎng)24h±2h，SC置于36℃±1℃培養(yǎng)24h±2h，抑制雜菌生長，富集沙門氏菌。

　　2)ELISA快速篩查

　　取出增菌液，按照ELISA檢測(cè)試劑盒說明書操作，提取樣品中的沙門氏菌抗原。

　　將抗原溶液加入包被有沙門氏菌特異性抗體的酶標(biāo)板孔中，37℃孵育一定時(shí)間，使抗原抗體充分結(jié)合；棄去孔內(nèi)液體，用洗滌液清洗3~5次，去除未結(jié)合物質(zhì)。

　　加入酶標(biāo)記的二抗，再次孵育、洗滌；隨后加入底物溶液，37℃避光顯色10~15min，最后加入終止液終止反應(yīng)。

　　用酶標(biāo)儀在特定波長下測(cè)定吸光度（OD值），與試劑盒臨界值（Cut-off值）對(duì)比：OD值≥臨界值為篩查陽性，需進(jìn)一步確證；OD值＜臨界值為篩查陰性。

　　3)分離確證（陽性樣品必做）

　　取篩查陽性的選擇性增菌液，劃線接種于沙門氏菌顯色培養(yǎng)基或麥康凱瓊脂培養(yǎng)基平板，36℃±1℃培養(yǎng)24~48h。

　　觀察菌落形態(tài)：沙門氏菌在顯色培養(yǎng)基上會(huì)呈現(xiàn)特定顏色的菌落，在麥康凱培養(yǎng)基上為無色透明或半透明菌落。

　　挑取疑似菌落，接種至三糖鐵瓊脂（TSI）等生化鑒定管，進(jìn)行生化反應(yīng)鑒定，同時(shí)可通過血清學(xué)試驗(yàn)確認(rèn)血清型，最終判定是否為沙門氏菌。